Skip to content

lublin szpital ul staszica

2 miesiące ago

256 words

Gdy 41-nt RNA LMNA zostało zmutowane w celu wyeliminowania potencjalnych miejsc wiązania SRSF2, wiązanie SRSF2 z RNA zostało znacznie zmniejszone (Figura 4B). Aby określić, czy wszystkie 3 miejsca wiążące SRSF2 wpływają na splatanie LMNA, wygenerowaliśmy konstrukt reporterowy do monitorowania splatania LMNA (Figura 4C). Fragment genomu egzon-10 do egzonu-12 zawierający mutację punktową HGPS (c.1824; C> T) subklonowano do plazmidu reporterowego RHCglo (33). Plazmid transfekowano do komórek HeLa, a transkrypty pochodzące od reportera badano za pomocą qRT-PCR. Zidentyfikowano wszystkie 3 przewidywane transkrypty (a -globinosulaminę A [glo-prelaminę A], glinoaminę C, glo-progerynę. Aby udokumentować, że system był zdolny do wykrywania zmian w ekspresji różnych produktów mRNA, komórki eksprymujące reporter transfekowano ASO E11-31. Po 2 dniach zaobserwowaliśmy znaczny spadek prelamin A i transkrypty progerynowe z konstruktu reporterowego (Figura 4D). Następnie zapytaliśmy, czy którekolwiek z potencjalnych miejsc wiązania SRSF2 były istotne dla wytwarzania transkryptów prelaminy A przez mutowanie każdego miejsca SRSF2 w konstrukcie reporterowym. Gdy zmutowano miejsce SRSF2 lub zachodzące na siebie miejsce SRSF6 / SRSF1, nastąpiła niewielka zmiana w ekspresji transkryptów prelaminy A. Jednakże, gdy zmutowano miejsce 2 SRSF2 lub miejsce 3, spadły poziomy prelaminy A i progeriny, a gdy oba te miejsca były zmutowane, spadek transkryptów prelaminy A był addytywny (Figura 4D, P <0,05). Następnie zbadaliśmy wpływ braku ekspresji SRSF2 w komórkach z nokautem SRSf2. Aby utworzyć fibroblasty z wyłączonym Srsf2, fibroblasty zarodkowe Srsf2fl / fl myszy (MEF) zainfekowano adenowirusem Cre (adeno-Cre), a poziom transkrypcji laminatu A i laminatu C mierzono 3 i 6 dni później. W obu punktach czasowych ekspresja Srsf2 była zmniejszona o> 95% w porównaniu z komórkami transdukowanymi wirusem kontrolnym (adeno-LacZ). W komórkach z niedoborem Srsf2 poziomy mRNA prelaminy A zmniejszono o połowę, podczas gdy poziom mRNA dla laminatu C prawie się podwoił; całkowite transkrypty Lmna pozostały niezmienione (Figura 5A, P <0,01). Podobne zmiany zaobserwowano na poziomie białka. W komórkach transdukowanych adeno-Cre. poziomy laminatu A były zmniejszone prawie o połowę (P <0,01), podczas gdy poziomy L-C były zwiększone około 1,5-krotnie (Figura 5B). Figura 5: Zawartości lamininy / prelaminy w komórkach i tkankach myszy zależą od ekspresji SRSF2. (A) Inaktywacja Srsf2 w mysich fibroblastach zmniejsza poziom transkryptu prelaminy A i zwiększa poziomy transkryptu L1 bez wpływu na całkowite transkrypty Lmna. Linię komórek fibroblastów Srsf2fl / fl myszy traktowano adeno-Cre lub adeno-LacZ. Po 3 lub 6 dniach poziomy prelaminy A i laminatu C zmierzono za pomocą qRT-PCR (średnia . SD). Poziomy mRNA Srsf2 były zmniejszone o> 95% w komórkach traktowanych adeno-Cre. (B) Western bloty pokazujące, że inaktywacja Srsf2 w fibroblastach prowadzi do obniżenia poziomów białka A w laminacie. Dwie linie komórkowe Srsf2fl / fl fibroblastów (linie komórkowe i 2) traktowano adeno-Cre lub adeno-LacZ. Po 6 dniach poziomy laminatu A i laminatu C oceniano metodą Western blotting. Wykres słupkowy pokazuje zmiany w ekspresji laminatu (średnia . SEM) dla 4 niezależnych eksperymentów. ** P <0,01, test t. (C) Western bloty pokazujące, że inaktywacja Srsf2 w wątrobie zmniejsza poziomy laminatu A i zwiększa poziomy laminatu C. Poziomy białka L i A i białka C mierzono w izolowanych hepatocytach myszy Srsf2fl / fl (P23) eksprymujących Cre w wątrobie (Srsf2fl / flAlb-Cre +). Poziomy aktyny mierzono jako kontrolę obciążenia. Wykres słupkowy pokazuje średnią. SEM dla 3 myszy na grupę. * P <0,05. W celu określenia, czy zubożenie SRSF2 wpływa na alternatywne splicing Lmna in vivo, zmierzono poziomy stanu stacjonarnego laminatu A i laminatu C w hepatocytach z myszy SRSf2-knockout specyficznych dla wątroby (myszy Srsf2fl / flAlb-Cre). [przypisy: klasyfikacja chorób, kaki kalorie, olx grójec ]

0 thoughts on “lublin szpital ul staszica”