Skip to content

dobry dermatolog dębica

3 miesiące ago

68 words

Jednak jeden ASO umiejscowiony w eksonie 11 (E11-31, odpowiadający c.1735. 1755) jednocześnie zmniejszył produkcję laminatu A i zwiększył produkcję laminatu C. Następnie użyliśmy ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) w celu przetestowania efektów nakładających się ASO z eksonem 11 (seria ASO, które różniły się od E11-31 w przyrostach 1-nt) na splicingu laminowanym C / prelaminą A. Kilka ASO (z sekwencjami <4 nt lub +4 nt w stosunku do E11-31) miało efekty podobne do tych z E11-31 (Figura 1A). Ta grupa ASO została nazwana. Lamin C. ASO.. ASO E11-31 został wybrany do dodatkowych testów. Zgodnie z naszymi badaniami przesiewowymi (Figura 1A), ASO E11-31 zwiększyło poziomy transkryptu L z C, jednocześnie obniżając poziomy transkryptu A (Figura 1B, P <0,05). ASO E11-31 również obniżyło poziomy białka L A i zwiększyło poziom białka L (w stosunku do aktyny) (Figura 1C). Siła działania ASO była związana z ich długością (20 nt> 18 nt> 16 nt) (Suplementowa Figura 2A). Zgodnie z oczekiwaniami, ASO nie wpłynęły na ekspresję innych jąder jądrowych (np. Laminatu B1) wytwarzanych z oddzielnych genów (dodatkowa Figura 2A). Rysunek 1: Identyfikacja regionu w eksonie 11 Lmna, który wpływa na ekspresję prelaminy A i L-C. (A) qRT-PCR identyfikuje kilka ASO, które zwiększają stosunek lamin C / prelaminy A. MEF typu dzikiego transfekowano nakładającymi się 18-nt ASO odpowiadającymi sekwencjom w eksonie 11 Lmna. Po 2 dniach poziomy mRNA dla prelaminy A, laminatu C i całkowitego laminatu A / C zmierzono za pomocą qRT-PCR. Całkowite poziomy A / C laminatu (czarne słupki) i proporcje laminatu C / prelaminy A (białe słupki) obliczono i wyrażono w stosunku do komórek traktowanych kontrolą (Con), ustawionych na wartość 1,0. (B) ASO E1-31 promuje spawanie laminowane. MEF typu dzikiego transfekowano ASO E11-26, E11-31, E11-36 i I10-11 (I10-11 umiejscowiono w 3 UTR laminatu C3). Po 2 dniach poziomy mRNA dla prelaminy A i laminatu C mierzono za pomocą qRT-PCR. Ekspresję znormalizowano do poziomów w komórkach, które traktowano samym odczynnikiem do transfekcji (kontrola bez zadawania [NTC]) (ustawiona na wartość 1,0). Średni. Pokazano SEM dla 3 niezależnych eksperymentów. Porównanie z kontrolą niedopuszczalną: * P <0,05; ** P <0,01, test t. (C) Western bloty pokazujące, że ASO modulują ekspresję białka L i C w laminacie. MEF transfekowano w dwóch powtórzeniach z ASO I11-146, I10-11, E11-26, E11-31 i E11-36. Po 2 dniach przygotowano ekstrakty komórkowe i analizowano je metodą blottingu Western z przeciwciałami przeciwko laminatowi A / C i aktynie. Intensywność pasm zmierzono za pomocą skaningu laserowego w podczerwieni i znormalizowano względem aktyny. Wyniki zostały wyrażone w stosunku do kontrolki nemplate, ustawionej na wartość 1,0. Aby określić, czy sekwencje regulatorowe, które odkryliśmy w mysim genie Lmna, miały związek z łączeniem L-cl / prelaminą A u ludzi, wygenerowaliśmy zachodzące na siebie ASO odpowiadające sekwencjom egzonowym 11 w ludzkim LMNA, a następnie testowaliśmy ASO w ludzkich fibroblastach skóry. Ludzkie ASO LMNA odpowiadające sekwencjom zidentyfikowanym w badaniach na myszach również przesunęły równowagę wyników LMNA bardziej w kierunku laminatu C w ludzkich fibroblastach, co oceniono za pomocą zarówno qRT-PCR (Figura 2A, P <0,01) i Western blot (Suplementowa Figura 2B) . Warto zauważyć, że ASO E11-31 był również aktywny w liniach ludzkich hepatocytów, chondrocytów i osteoblastów (Figura 2, B i C). Figura 2ASO modulują ekspresję LMNA. (A) ASO modulują alternatywne splicing LMNA w ludzkich komórkach. Potrójne studzienki ludzkich fibroblastów typu dzikiego (klon CRL-2429) transfekowano ASO E11-26, E11-28, E11-31, E11-33, E11-36, E11-38 i E11-41. Po 3 dniach poziomy mRNA prelaminy A i laminatu C mierzono za pomocą qRT-PCR. Dane są wyrażane w odniesieniu do komórek potraktowanych zaszyfrowaną ASO (Con) (ustawione na wartość 1,0) [podobne: kalarepa kalorie, kolano budowa, jarmuż właściwości ]

0 thoughts on “dobry dermatolog dębica”