Skip to content

cukrzyca u dzieci i młodzieży

2 miesiące ago

170 words

Program do identyfikacji potencjalnych miejsc wiążących ESE (ESEFinder; http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi.process=home) znalazł 3 potencjalne miejsca dla czynnika splicingu bogatego w serynę / argininę 2 (SRSF2, znany również jako SC35), 2 dla SRSF1 (znanego również jako SF2 lub ASF), a dla SRSF6 (znanego również jako SRp55) (dodatkowa Figura 3). Aby ustalić, czy te ESE regulują splatanie LMNA, rozpoczęliśmy od przeprowadzenia badań knockdown siRNA. Fibroblasty ludzkiej skóry typu dzikiego transfekowano siRNA dla SRSF1, SRSF2 i SRSF6; te siRNA obniżyły poziomy transkryptu SRSF1, SRSF2 i SRSF6 o> 80%. Efekty stłumienia siRNA na laminacie A i laminacie C badano metodą Western blotting. Jako kontrolę pozytywną, transfekowaliśmy komórki siRNA LMNA i stwierdziliśmy, jak oczekiwano, że siRNA wyraźnie zmniejszył ekspresję laminatu A / C (Figura 4A). Powalenie SRSF1 lub SRSF6 nie miało wpływu na ekspresję laminatu A / C; jednakże powalenie SRSF2 przesunęło wyjście z genu LMNA do zwiększonych ilości laminatu C i mniejszych ilości prelaminy A (Figura 4A, P <0,05). Figura 4SRSF2 moduluje alternatywne splicing LMNA. (A) znoszenie siRNA z SRSF2 zwiększa poziomy laminatu C w komórkach ludzkich. Fibroblasty dzikiego typu transfekowano siRNA przeciwko SRSF1, SRSF2 i SRSF6, a poziomy L A i C zmierzono metodą Western blotting. Poziomy aktyny mierzono jako kontrolę obciążenia. Poziom transkryptu dla SRSF1, SRSF2 i SRSF6 został obniżony o. 80%. Średni. Pokazano SEM dla 3 niezależnych eksperymentów. * P <0,05; ** P <0,01, test t. (B) SRSF2 wiąże się z sekwencjami RNA eksonów 11. Cząsteczki RNA odpowiadające nt 22. 63 LMNA egzonu 11 były biotynylowane i wiązały się z kulkami streptawidynowymi. Wiązanie SRSF2 znakowanego HA oznaczono metodą Western blotting. Wiązanie SRSF2 z RNA typu dzikiego porównywano z tym do zaszyfrowanej cząsteczki RNA, z dodatkiem 30-krotnego nadmiaru nieznakowanego RNA i cząsteczek RNA, w których zmutowano miejsca SRSF2. (C) Schemat ideowy konstruktu reportera LMNA. Fragment LMNA (obejmujący egzony 10. 12) sklonowano za fragmentem glo (zabarwiony na czerwono), napędzany przez promotor RSV (czarna strzałka). Pokazano sekwencje 3 przewidywanych miejsc SRSF2 i pojedynczego przewidywanego miejsca SRSF6 (SRp55) w eksonie 11. Czerwona gwiazdka identyfikuje lokalizację mutacji HGPS (ok. 1824; C> T). Reporter daje 3 transkrypty (glo-prelaminę A, glo-lamin C i glo-progerynę). (D) Badania reporterów pokazujące, że miejsca 2 i 3 SRSF2 są ważne dla składania RNA prelamizy LMNA. Komórki HeLa zostały kotransfekowane przy użyciu reportera LMNA i tylko FLO-only. plazmid. Po 2 dniach kwantyfikacja glo-prelaminą A, glo-progeryną i transkryptami z limfocytów C została określona ilościowo za pomocą qRT-PCR i znormalizowana do poziomu transkryptu zawierającego wyłącznie glony. Pokazano zmiany w ekspresji w stosunku do reportera typu dzikiego (ustawione na wartość 0), dla 5 niezależnych doświadczeń (średnia . SEM). Doświadczenia z knockdowniem siRNA potwierdziły rolę SRSF2 w splicingu LMNA. Aby określić, czy SRSF2 wiąże się z odpowiednimi sekwencjami LMNA, przeprowadziliśmy badania nad rozkładem RNA. Cząsteczki RNA (o długości 41-nt) obejmujące całą sekwencję 20-nt w ASO E11-31 były biotynylowane na końcu 3a, a następnie wiązały się z kulkami streptawidyny. Wyciągi jądrowe z komórek HEK293 eksprymujących znakowany hemaglutyniną (znakowany HA) SRSF2 inkubowano z kulkami; następnie przeprowadzano Western blotting w celu określenia wiązania SRSF2 znakowanego HA z unieruchomionymi RNA. Silne wiązanie SRSF2 obserwowano z sekwencją LMNA typu dzikiego (Figura 4B), ale obserwowaliśmy jedynie słabe wiązanie z tym samym RNA typu dzikiego w obecności nadmiaru nieznakowanego (niebiotynylowanego) RNA typu dzikiego. Zaobserwowaliśmy również słabe wiązanie z wymieszanym RNA 41-nt (Figura 4B)
[patrz też: lepiej późno niż później cda, kolano budowa, kaki kalorie ]

0 thoughts on “cukrzyca u dzieci i młodzieży”

  1. [..] odnosnik do informacji w naukowej publikacji odnosnie: syropy niskokaloryczne[…]