Skip to content

brodawki płaskie jak się ich pozbyć

3 miesiące ago

566 words

Białka frakcjonowano pod względem wielkości na żelu Bis-Tris o gradacji 4%> 12% gradientu poliakrylamidu (Invitrogen) i przeniesiono na błony nitrocelulozowe. Membrany inkubowano z następującymi przeciwciałami: kozie przeciwciało poliklonalne przeciw laminatowi A / C (1: 400; sc-6215, Santa Cruz Biotechnology); kozie poliklonalne przeciw aktynie (1: 2000, sc-1616, Santa Cruz Biotechnology); przeciwciała drugorzędowe znakowane barwnikiem podczerwieni (Rockland Immunochemicals). Sygnały w podczerwieni oznaczono ilościowo za pomocą skanera podczerwieni Odyssey (LI-COR Biosciences). Mikroskopia immunofluorescencyjna. Komórki na szkiełkach nakrywkowych utrwalono lodowatym metanolem, przepłukano acetonem i przepuszczono przez 0,2% Triton. Komórki zostały poddane obróbce pod mikroskopem immunofluorescencyjnym, jak opisano wcześniej (13). Zastosowano następujące przeciwciała: mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko laminacie A (Abcam); królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko laminowaniu C (Novus Bio); Alexa Fluor 488a znakowany kozim anty-mysim IgG (Invitrogen); i Alexa Fluor 568fznakowane osiołkowe anty-królicze IgG (Invitrogen). Obrazy konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej uzyskano za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej Zeiss LSM700 z planem Apochromat × 20 / 0,80 NA obiektyw (powietrze), a obrazy wzdłuż osi Z zostały przetworzone przez oprogramowanie Zen 2010 (Zeiss) w celu wygenerowania maksymalnych projekcji obrazu. Liczenie komórek. Maksymalne obrazy komórek wyświetlających obraz zostały zaimportowane do ImageJ i przekształcone na skalę szarości, a próg został dostosowany w celu identyfikacji jąder. Intensywność sygnału laminatu A rejestrowano dla każdego jądra w obrazie przy użyciu wielkości pikseli cząstek od 200 do nieskończoności. Dla każdego obrazu obliczono średnią intensywność i odchylenie standardowe. Jądra, które miały więcej niż odchylenie standardowe poniżej średniej dla intensywności laminatu A, zostały ocenione pod kątem anomalii kształtu jądra przez dwóch obserwatorów niewidomych w grupie leczonej. qRT-PCR. Całkowity RNA wyizolowano i traktowano DNazą I (Ambion, Life Technologies). RNA poddano odwrotnej transkrypcji losowymi starterami, oligo (dT) i SuperScript III (Invitrogen). Reakcje qPCR przeprowadzono w systemie 7900 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems) z mieszaniną SYBR Green PCR Master Mix (Bioline). Poziomy transkryptu określono za pomocą metody progu cyklu porównawczego i znormalizowano do poziomów cyklofiliny A (dla próbek myszy) lub GAPDH (dla próbek ludzkich). Wszystkie startery wymieniono w tabeli 1. Test reportera LMNA. Komórki HeLa wysiano na 6-studzienkowe płytki i pozostawiono do przylgnięcia przez noc. Komórki przepłukano pożywką Opti-MEM I (Invitrogen), transfekowano ASO (31 lub 15,5 nM) przy użyciu 4,5 ul / ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen), a następnie umieszczono w 37 ° C na 6 godzin według producenta. s instrukcje. Pożywkę transfekcyjną usunięto i zastąpiono świeżą pożywką hodowlaną. Następnego dnia komórki kotransfekowano plazmidem RHCglo-LMNA (1 ng / ml) i plazmidem RHCglo (0,5 ng / ml) stosując Fugene 6 (4 (il / ml) (Promega). Plazmid RHCglo włączono w celu znormalizowania pod kątem różnic w skuteczności transfekcji. Całkowity RNA wyizolowano 2 dni później, a ekspresję genu mierzono za pomocą qRT-PCR. Specyficzne dla plazmidu prelaminę A, lamin C i transkrypty progerynowe amplifikowano za pomocą wspólnego przedniego startera i unikalnych primerów odwrotnych. Powszechnym starterem był 5. -CATTCACCACATTGGTGTGC-3 ., a unikalne primery odwrotne dla prelaminy A, laminu C i progeriny stanowiły 5. -AGGCAGAGAGCCGAGGAGA-3 ., 5. -AGCGGCGGCTACCACTCA-3. I 5. -CATGATGCTGCAGTTCTGGGGGCTCTGGAC- 3 ., odpowiednio. Plazmid RHCglo amplifikowano stosując ten sam wspólny przedni starter i starter odwrotny 5. -CGGTAAGAGCAAGCTGGTCA-3 .. Test rozwijania RNA. Cząsteczki RNA (o długości 41-nt) zostały zsyntetyzowane przez Integrated DNA Technologies; 50 pmoli każdego RNA biotynylowano na 3 końcu z desthiobiotinylowaną cytydyną zgodnie z instrukcjami producenta (Life Technologies)
[hasła pokrewne: jarmuż właściwości, kłykciny kończyste objawy, olx trojmiasto ]

0 thoughts on “brodawki płaskie jak się ich pozbyć”