Skip to content

Autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny z mutacjami Somatic Fas ad

2 miesiące ago

478 words

U dwóch pacjentów z mutacjami kaspazy 10 stwierdzono ALPS typu II, który charakteryzuje się opornością na apoptozę Fas, pomimo obecności normalnego ligandu Fas i Fas. W przypadku ALP typu III apoptoza z udziałem Fas jest również normalna in vitro 19, a wada genetyczna jest niejasna. Pacjenci z ALPS typu III mogą nie mieć wszystkich czterech klasycznych cech zespołu – limfoproliferacji, nadmiernej liczby podwójnie ujemnych komórek T, hipergammaglobulinemii i objawów autoimmunologicznych. Wiele przypadków ALPS typu III ma charakter sporadyczny, co wyklucza zastosowanie podejścia genetycznego do identyfikacji wady molekularnej. W niniejszym badaniu uzyskaliśmy limfocyty od sześciorga dzieci z ALPS typu III do dogłębnej analizy. Metody
Pacjenci
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka kliniczna i immunologiczna szóstki pacjentów z autoimmunologicznym zespołem limfoproliferacyjnym typu III. Próbki krwi pobrano od sześciu pacjentów, ich rodziców i pięciu zdrowych osób kontrolnych. Wszyscy poddani lub ich rodzice lub opiekunowie wyrazili pisemną, świadomą zgodę, zatwierdzoną przez Comité Consultatif pour la Protection des Personnes en Recherche Biomédicale. Tabela podsumowuje cechy kliniczne sześciu pacjentów.
Hodowla komórkowa, test apoptozy i analiza repertuaru receptora komórek T
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej wyizolowano ze świeżo pobranej krwi traktowanej heparyną za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque. Testy apoptozy i analizę repertuarową przeprowadzono odpowiednio na aktywowanych komórkach T i krwi pełnej, jak opisano wcześniej.16,20
Przygotowanie kwasu nukleinowego, amplifikacja i wykrywanie mutacji Fas
Całkowity RNA wyizolowano ze świeżo wyizolowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i komórek T, które zostały aktywowane przez dziewięć dni ekspozycji in vitro na fitohemaglutyninę. Test odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio. 16, 16 DNA wyekstrahowane z limfocytów aktywowanych fitohemaglutyniną lub oczyszczonych podwójnie negatywnych komórek T amplifikowano z oligonukleotydami obejmującymi dziewięć eksonów Fas z zastosowanie warunków PCR opisanych gdzie indziej, 16 z tym wyjątkiem, że temperatury hybrydyzacji dla eksonów 4 i 7 wynosiły odpowiednio 58 ° C i 60 ° C. Podgrupy leukocytów oczyszczano przez sortowanie komórek (oczyszczanie zawsze przekraczało 95 procent) za pomocą aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek (FACS) (FACStarPLUS, Becton Dickinson) z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, jak opisano wcześniej. DNA z tych podgrup amplifikowano przez zagnieżdżenie PCR. Sekwencjonowanie przeprowadzono bezpośrednio na produktach PCR z użyciem zestawu do sekwencjonowania DNA Big Dye (Perkin-Elmer) i automatycznego sekwencera ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). W celu oznaczenia ilościowego, produkty PCR odpowiadające eksonowi fas Fason zligowano z wektorem TOPO za pomocą Podręcznika do klonowania TOPO-TA (Invitrogen) i co najmniej 60 klonów indywidualnie zsekwencjonowano. Przeprowadzono PCR specyficzny dla allelu przy kolejnym użyciu dwóch zestawów starterów. Pierwszy etap amplifikował ekson Fas w obu allelach; w drugim etapie amplifikowano zmutowany lub allel typu dzikiego. Produkty PCR rozdzielono na 1,5% żelu agarozowym i przeniesiono do membrany do transferu hybrydyzacji (NEN Life Science Products)
[więcej w: cienki kał, endometrium niejednorodne, papkowaty stolec ]
[podobne: jak szybko obniżyć ciśnienie, jarmuż właściwości, zimbra gratka ]

0 thoughts on “Autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny z mutacjami Somatic Fas ad”